自上世纪 70 年代问世以来，酶联免疫吸附测定作为一种简便、快速的微量蛋白的定量测定方法，已广泛应用于生物学和医学的许多领域。
酶联免疫吸附测定(ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)是将抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合的一种新型的免疫测定技术 。 其可分为以下四大类：直接 ELISA、间接 ELISA、夹心 ELISA 和竞争抑制 ELISA。 而其中，最广泛用于目标抗原或抗体的定量检测方法就是双夹心 ELISA(Double Sandwich ELISA)，其通过将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，通过待测抗原与包被抗体反应，接着加入酶反应的底物，将底物催化成有色产物，最后根据呈色的深浅进行定量分析。
作为一种高灵敏度的定量检测手段，双夹心 ELISA 需要通过将样品的吸光度值代入相应的标准曲线后才可确定终浓度。因此，标准曲线的绘制和拟合对于实验的成功与否至关重要。而对于初学者来说，面对众多的 ELISA 数据分析 软件(如 EXCEL、SPSS、CurveExpert、Origin 等等)，往往不知如何选择和使用。由于 EXCEL 是其中科学工作者日常最普遍的软件之一，因此接下来我们将以此为例，具体介绍一下典型的双夹心法标准曲线的拟合步骤。
我们选用了 Cloud-Clone 公司的 SEA079Ra，ELISA Kit for Interleukin 6 (IL6)的一次质检标准品吸光度值作为参考，如图 1 所示，实验人员从最高 100 pg/mL 浓度的标准品(H1孔)，经倍比稀释至 1.56 pg/mL 浓度(B1孔)，阴性对照孔为标准品稀释液(第 A1孔)。
图 1. 标准品吸光度值参考
首先，将各孔的吸光度值减去阴性对照孔吸光度值(本底)，得到校正后的吸光度值(如图 2 所示的绿色突出显示部分)，接着，以校正后的吸光度值为 x 轴(Optical Density)， 相应的标准品浓度为 y 轴(Concentration (pg/mL)，作 XY 散点图，得到一条 7 点曲线。（此类曲线一般为直线、近似直线 或 S 型(如图 3 所示)。
图 2. 标准品吸光度纠正值
图 3. 标准曲线示例图
接着，在该曲线中任选一点以右键打开，选择”添加趋势线(R)”，图表上 便会弹出一个对话框。当目测标准曲线为直线或近似直线时，则可在“类型” 选项中选择“线性(L)”，而当目测标准曲线为 S 型时，则可在“类型”选项中 选择“多项式(P)”并将“阶数(P)”设定为 2 阶。
最后，在“选项”中勾选“显 示公式(E)”和“显示 R 平方值(R)”（如图 4 所示)，点确定，便会出现标准曲线的对应公式及R²值(如图 5 所示)。
图 4. 添加拟合公式的过程示意图
图 5. 典型带拟合公式的标准曲线示意图
样本浓度的测算示例(如 图6 所示)：
1. 利用EXCEL图标作图，标曲浓度作为Y轴，标曲校正值(标准品O.D.值减去空白对照O.D.值)为X轴，做一元二次方程(y=aX^2+bX+c);
2. 将样本的校正值(样本O.D.值减去空白对照O.D.值)作为X带入公式中，得到Y值。若样本原液检测，测算的Y值为样本中目的物的浓度，若样本稀释后检测，测算的Y值乘以稀释倍数，为样本中目的物的浓度。。
| Calculation of Sample Concentration | |||
| 样本原液检测 | Sample O.D. | Corrected Sample O.D. | Calculated Concentration(pg/ml) |
| 阴性对照孔吸光度值(本底)：0.115 | 0.433 | 0.318 | 5.23170222 |
| 0.563 | 0.448 | 8.572554202 | |
| 1.123 | 1.008 | 24.33289315 | |
| 样本稀释10倍后检测 | Sample O.D. | Corrected Sample O.D. | Calculated Concentration(pg/ml) |
| 阴性对照孔吸光度值(本底)：0.115 | 0.433 | 0.318 | 52.3170222 |
| 0.563 | 0.448 | 85.72554202 | |
| 1.123 | 1.008 | 243.3289315 | |
| 以上采用标准曲线拟合方程均为 图5 所示：y = 3.5429x² + 22.985x - 2.4358 R²= 0.9998 |
|||
在了解了标准曲线的绘制方法之后，我们如何判断一条标准曲线是否良好呢？一般而言，一条好的标准曲线应具备以下三点：
1）阴性对照孔 O.D. 值小于 0.25；
2）R²值大于 0.95，越接近 1 越好；
3）最高浓度孔的标准品吸光度值应至少大于 0.8。
最后，我们将绘制和分析标准曲线过程中常见的问题及相应的解决方案总结如下：
| 常见问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 阴性对照孔 O.D. 值偏高 | 阴性对照孔被其它孔污染 | 使用加样器要更换新的吸头、使用新的容器和覆膜 |
| R²值低 | 标准品溶解不充分 | 进行正确的标准品溶解 |
| 标准品稀释不正确 | 进行正确的标准品梯度稀释 | |
| 加样不精确 | 检查和校正移液器 | |
| 重复利用吸头、容器和覆膜 | 使用加样器要更换新的吸头、使用新的容器和覆膜 | |
| 标准品吸光度值偏低 | 标准品溶解不充分 | 进行正确的标准品溶解 |
| 标准品稀释不正确 | 进行正确的标准品梯度稀释 | |
| 加样不精确 | 检查和校正移液器 | |
| 温育时间不正确 | 保证充足的温育时间 | |
| 温育温度不正确 | 试剂要平衡至室温并保证准确的温育温度 | |
| 酶标记物或底物失效 | 通过混合酶标记物和底物，颜色应迅速显现来检查 | |
| 没有加入终止液 | 按照说明书实验操作步骤加入终止液 |
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