蛋白质印迹（Western blotting，WB）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
实验操作指南：
一、电泳：
1、根据目标蛋白的分子量(MW)配置合适的SDS-PAGE胶。
注：①Tris-tricine gel比 Tris-glycine gel更好的分离低分子量蛋白(<10kDa)；②梯度胶可以提供更清晰的条带，在一种凝胶上提供更大的蛋白检测范围，如10~500kDa。
2、在离心管中制备样品。添加SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，使每个样品的总蛋白量需至少准备20-50μg（蛋白定量可选择Bradford或BCA试剂盒分析测定）。
3、混匀样品，然后加热至95~100℃，5min。
4、浓缩凝胶凝固后，拆卸梳子，将凝胶放入电泳室，在内外储层加电泳缓冲液。将样本和适量预染色蛋白Marker(Cat No.NB006)装入孔中（每个样本20-50ug总蛋白）。
5、盖上盖子，并将电极插头连接到合适的电极上。打开电源调整电压至80V，电泳约30分钟。当样品形成单条窄线并进入分离胶时，将电压转换为150V，当移至凝胶底部时，停止电泳（大约需要40-60min）。
二、蛋白转移(以湿转为例）:
1、推荐使用PVDF膜（只有当目标蛋白分子量<20kDa时，使用0.22μm孔径的PSQ膜）。将膜在甲醇中浸泡30秒，用超纯水冲洗两遍，然后用Western Blot湿法转膜液浸泡。将滤纸和海绵也浸泡在预冷转膜缓冲液中。
2、将胶从电泳槽中取出，浸泡在转膜液中。
3、以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡。
4、采用恒流法(50 mA，转膜过夜）进行转膜。
5、转膜完成后，将膜取出，用超纯水冲洗两遍，放入Western Blot封闭液中进行封闭，室温两小时或4℃过夜。
注：①如果目标MW大于150kDa，建议4°C湿转过夜，而且最好在转移缓冲液中添加0.005% SDS以便更好的转移大分子蛋白；②如果需要观察蛋白转移情况，可用丽春红染膜，观察完用PBST清洗干净。
三、免疫印迹：
1、将膜从封闭液中取出，用1xPBST洗膜三次，每次5分钟。
2、根据推荐稀释度用抗体稀释液稀释一抗，37℃孵育1小时或4°C过夜。
3、用1xPBST清洗膜三次，每次10分钟。
4、根据推荐稀释度稀释二抗，将膜放入其中孵育，37℃孵化1小时。
5、用1xPBST清洗膜三次，每次10分钟。
6、用超纯水将膜冲洗两遍。
四、曝光：
1、配制ECL发光液：ECL底物A液和B液1:1混匀后使用。
2、在暗室里，将PVDF膜浸润在ECL底物溶液1min左右，然后用保鲜膜将PVDF膜包好。
3、使用化学发光成像仪曝光(根据多次曝光时间来确定最佳曝光时间)。
更多产品信息，请访问：www.anewbiosystems.com
新舟生物可为广大科研工作者提供30000+种免疫学生命科学试剂，核心产品涵盖抗体检测芯片、真核植物蛋白、蛋白、抗体和试剂盒等，旨在为科研工作者提供专业、全面、可靠的试剂支持，推动生命科学研究的深入发展。
我们的使命——提供客观性能产品，提升科研支撑保障力，助力新质生产力发展！
