免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)定义：通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究。
免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)优势:虽然IHC 在定量方面不如Western Blot或 ELISA，但是它可以提供有关蛋白定位的宝贵信息。蛋白表达模式对研究和医疗保健具有极大的价值，也可作为重要的诊断工具，用于确定肿瘤等疾病中的异常细胞。
一、样本处理
1. 烘片：60℃烘片0.5-2小时。
二、脱蜡
1. 脱蜡水化：烘片结束后，石蜡切片依次置于以下试剂中：
1）二甲苯I：30 min
2）二甲苯II：30 min
3）100%乙醇：10 min
4）95%乙醇：10 min
5）80%乙醇：10 min
6）70%乙醇：10 min
- 纯水/去离子水冲洗10 min
注：脱蜡彻底，以免影响后续实验。
三、抗原修复
1. 抗原修复-微波炉抗原热修复法（可选）：将组织切片转移到沸腾的EDTA-Tris 溶液中使其完全浸透。低火加热一分钟，停止加热并静置于微波炉中10min。然后再低火加热3-4分钟，停止加热，使EDTA-Tris 溶液在室温自然冷却。
注：组织在经过福尔马林的固定之后，蛋白质发生交联，抗原被封闭。抗原修复缓冲液在热的条件下可以使被福尔马林屏蔽的抗原重新暴露出来，同时又不会对抗原表位造成破坏，从而提高抗原的检出率，降低背景染色，提高实验结果的准确率。
四、免疫组织化学染色
1. 洗涤：PBS洗三次，甩去残夜，正面朝上，没入PBS中，摇床漂洗(40RPM)，每次5min；
2. 阻断内源过氧化物酶：用3%-5% H2O2-水(甲醇)溶液，200ul/片，室温孵育10min；
注：过氧化物酶灭活不充分会导致假阳性。因为很多组织中含有丰富的内源性过氧化物酶，而且热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用亲和素-抗生物素系统会产生假阳性。
3. 洗涤：PBS洗三次，甩去残夜，正面朝上，没入PBS中，摇床漂洗(40RPM)，每次5min；
4. 非特异性位点的封闭:3次洗涤之后甩去残夜，滴加含有5% BSA的PBS溶液覆盖切片，约200ul/片，室温孵育30min；
5. 孵育一抗：去除残留，用已稀释至工作液的一抗4℃孵育过夜（推荐使用）或37℃孵育60min，约100ul/片；
6. 复温：将切片从4℃移至室温静置约需20min；
7. 洗涤：PBS洗三次，甩去残夜，正面朝上，没入PBS中，摇床漂洗(40RPM)，每次5min；
8. 孵育HRP标记的二抗：去除残留物，用已稀释至工作液的二抗4℃孵育60min，约60~100ul/片；
9. 洗涤：PBS洗三次，甩去残夜，正面朝上，没入PBS中，摇床漂洗(40RPM)，每次5min；
10.显色：使用DBA试剂盒（Cat# IS046）进行组织切片的显色。按照说明书混合试剂A和B，在切片上滴加适量新鲜配制的DBA溶液，室温孵育0.5~10min，直到出现棕色，用蒸馏水/去离子水终止显色并清洗切片；
11.苏木精复染：蒸馏水/去离子水漂片后甩去残夜，滴加苏木精染液覆盖切片，约100u/片，室温孵育2min，滴加1%盐酸酒精分色1s，蒸馏水/去离子水冲洗；
12.PBS或淡氨水返蓝:甩去残夜，滴加PBS或淡氨水溶液覆盖切片，约100ul/片，室温孵育10min；
13.脱水与二甲苯透明:切片依次于纯水，70%、80%、95%、100%11、100%IZ醇中各10min，再置于二甲苯工中透明30min
14.封片：中性树胶封片，65℃过夜烘干，镜检。
更多产品信息，请访问：www.anewbiosystems.com
新舟生物可为广大科研工作者提供30000+种免疫学生命科学试剂，核心产品涵盖抗体检测芯片、真核植物蛋白、蛋白、抗体和试剂盒等，旨在为科研工作者提供专业、全面、可靠的试剂支持，推动生命科学研究的深入发展。
我们的使命——提供客观性能产品，提升科研支撑保障力，助力新质生产力发展！
