一、制作标准曲线（测定细胞具体数量）

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2. 按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3~6个复孔。

3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D.值，制作出一条以细胞数量为横坐标，O.D.值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，尤其加入CCK-8后的培养时间要一致）。

二、细胞活性检测

1. 在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5% CO₂）。

2. 向每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响O.D.的读数）。

3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4. 用酶标仪测定450nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D.值，可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增殖-毒性检测（以96孔板为例）

1. 在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl约2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl约5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行预培养。

2. 向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。

4. 每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响O.D.读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5. 在细胞培养箱内继续孵育1~4小时（对于大多数情况孵育1小时就可以）。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2 和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7. 如果暂时不测定O.D.值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化或还原特性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（先用培养基洗涤细胞两次），去掉药物影响。如果药物影响比较小，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

本试剂盒是一种基于WST（水溶性四唑盐，一种类似于MTT的化合物）的细胞增殖与活性/毒性检测试剂盒，是用于细胞增殖和细胞毒性的迅捷极高灵敏度检测试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料，甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

本试剂盒是预制即用型CCK-8溶液，使用十分便捷，无需其它准备步骤。可直接使用96孔板或384孔板在酶标仪上检测，非常适合大规模、高通量的样品检测。

1、用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞增殖的测定、细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。

2、用于大规模，高通量的样品检测。

避光保存：-20℃，两年有效；4℃保存，一年有效。避免反复冻融。

1. CCK-8溶液对细胞的毒性大小如何？

答：CCK-8溶液对细胞的毒性非常低。细胞在CCK-8法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极为珍贵，否则不推荐把CCK-8溶液孵育过的细胞用于其它实验。

2. 细胞接种后需要培养多久加入CCK-8溶液？

答：细胞接种后，贴壁细胞大约需要培养2-4小时贴壁，悬浮细胞则可省去该步培养。

3. 加入药物的培养时间是多少？

答：要看药物的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的周期。

4. 如果吸光度值太低，可以采取什么办法解决？

答：细胞的种类不一样，形成的甲臜的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的甲臜很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

5. 颜色不均匀的话，怎么办？

答：如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀。

6. 没有450nm滤光片怎么办？

答：如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在450-490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。（建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。）

如果样品为高浑浊度的细胞悬液，可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

一、增殖分析

细胞活力*（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）] ×100

A（加药）：含有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；

A（空白）：含有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度；

A（0 加药）：含有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。

二、毒性分析

IC50的计算方法按照以下公式计算细胞存活率，绘制成图表，细胞存活率50%的值即为IC50%。

细胞存活率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As：实验孔（含有细胞、培养基、CCK-8、毒性物质）

Ac：对照孔（含有细胞、培养基、CCK-8，无毒性物质）

Ab：空白孔（含有培养基、毒性物质、CCK-8，无细胞）

1. 由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2. CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。

3. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

4. 建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰O.D.读数。

5. 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔（100μl培养基），且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，需先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6. 加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或pH值变化，建议换用新鲜的培养基。

7. 酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。